RNAse hemill
Murine RNase inhibitor er raðbrigða músa RNase hemill tjáður og hreinsaður úr E.coli.Það binst RNase A, B eða C í 1:1 hlutfalli með ósamgildum tengingum og hindrar þannig virkni ensímanna þriggja og verndar RNA fyrir niðurbroti.Hins vegar er það ekki áhrifaríkt gegn RNase 1, RNase T1, S1 Nuclease, RNase H eða RNase frá Aspergillus.Murine RNase inhibitor var prófaður með RT-PCR, RT-qPCR og IVT mRNA, og var samhæfður við ýmsa viðskiptalega bakrita, DNA pólýmerasa og RNA pólýmerasa.
Í samanburði við manna RNase hemla, inniheldur músa RNase hemill ekki tvö cystein sem eru mjög viðkvæm fyrir oxun sem veldur óvirkjun á hemlinum.Það gerir það stöðugt við lágan styrk DTT (minna en 1 mM).Þessi eiginleiki gerir það hentugt til notkunar í viðbrögðum þar sem hár styrkur DTT hefur skaðleg áhrif á viðbrögðin (td rauntíma RT-PCR).
Aumsókn
Þessi vara er hægt að nota mikið í hvaða tilraun sem er þar sem RNase truflun er möguleg til að forðast niðurbrot RNA, svo sem:
1.Nýmyndun fyrsta strengs cDNA, RT-PCR, RT-qPCR, osfrv.
2.Ver RNA fyrir niðurbroti við umritun/þýðingu in vitro (td in vitro veiruafritunarkerfi).
3.Hindrun á virkni RNase við aðskilnað og hreinsun RNA.
Geymsluskilyrði
Varan má geyma við -25～- 15 ℃, gildir í 2 ár.
Geymsla biðminni
50 mM KCl, 20 mM HEPES-KOH (pH 7,6, 25 ℃), 8 mM DTT og 50% glýseról.
Skilgreining eininga
Magn RNase hemils úr músum sem þarf til að hindra virkni 5ng af ríbónúkleasa A um 50% var skilgreint sem ein eining (U).
Mólþyngd próteins
Mólþungi RNase hemils úr músum er 50 kDa.
Gæðaeftirlit
Exonuclease Virkni:
40 U af músa RNase hemli með 1 μg λ -Hind III melt DNA við 37 ℃ í 16 klukkustundir gefur ekkert niðurbrot eins og ákvarðað er með agarósa gel rafdrætti.
Virkni innkirtla:
40 U af músa RNase hemli með 1μ g λ DNA við 37 ℃ í 16 klukkustundir gefur ekkert niðurbrot eins og ákvarðað er með agarósa gel rafdrætti.
Nicking Virkni:
40U af músa RNase hemli með 1μ g pBR322 við 37 ℃ í 16 klukkustundir gefur ekkert niðurbrot eins og ákvarðað er með rafdrætti á agarósageli.
RNase Virkni:
40U af músa RNase hemli með 1,6μ g MS2 RNA í 4 klst við 37 ℃ gefur ekkert niðurbrot eins og ákvarðað er með agarósa gel rafdrætti.
E.coli DNA:
40 U af músa RNase hemli er skimað fyrir tilvist E. coli erfðaefnis DNA með því að nota TaqMan qPCR með primerum sem eru sérstakir fyrir E. coli 16S rRNA stað.E. coli erfðafræðilega DNA mengunin er ≤ 0,1 pg/40 U.
Nathugiðs
1. Ofbeldissveifla eða hræring mun leiða til óvirkjunar ensíma.
2. Ákjósanlegur hitastigssvið þessa hemils var 25-55 ℃ og það var óvirkt við 65 ℃ og yfir.
3. Virkni RNase H, RNase 1 og RNase T1 var ekki hamlað af músa RNase hemli.
4.Hömlun á RNase virkni fannst á breitt svið pH (pH 5-9 voru öll virk), og mesta virknin sást við pH 7-8.
5. Þar sem ríbónúkleasar halda venjulega virkni við eðlisbreytingarskilyrði, verður að gæta þess að forðast eðlisbreytingu RNase Inhibitor sameindir sem hafa myndast við ríbónúkleasa.Til að koma í veg fyrir losun virks ríbónúkleasa skal forðast hærra hitastig en 50°C og háan styrk þvagefnis eða annarra náttúruverndarefna.
