Uracil DNA glýkósýlasa
Uracil-DNA Glycosylasi (UNG eða UDG) er raðbrigða klón E.coli með mólmassa 25 kDa.Það hvetur losun óbundins úracíls úr einþátta og tvíþátta DNA sem inniheldur úrasíl og er óvirkt gegn RNA og er hægt að nota til að koma í veg fyrir mengun PCR mögnunarafurða.Verkunarreglan byggir á þeirri staðreynd að ef dUTP er skipt út fyrir dTTP í PCR hvarfinu og PCR mögnunarafurð myndast sem inniheldur dU basa, getur ensímið valið brotið glýkósíðtengi U basa í einþátta og tvíþátta DNA og brjóta niður PCR mögnunarafurðina.
Mælt er með umsókn
Forvarnir gegn mengun Mögnun
Geymsluástand
-20°C til langtímageymslu, ætti að blanda vel saman fyrir notkun, forðast tíða frost-þíðingu.
Geymsla biðminni
20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, stöðugleiki, 50% glýseról.
Eining Skilgreining
Magn ensíms sem þarf til að brjóta niður 1µg af einþátta DNA sem inniheldur dU basa á 1 klukkustund við 37°C er 1 eining.
Gæðaeftirlit
1.SDS-PAGE rafhleðsluhreinleiki meiri en 98%
2.Mögnunarnæmi, lotu-til-lotu stjórn, stöðugleiki
3.Eftir að 1U af UNG hefur verið meðhöndlað við 50 ℃ í 2 mínútur ætti sniðmátið sem inniheldur U undir 103 eintökum að vera alveg niðurbrotið og ekki er hægt að framleiða mögnunarafurð
4.Engin utanaðkomandi núkleasavirkni
Leiðbeiningar
| Íhlutir | Rúmmál (μL) | Endanleg einbeiting |
| 10 × PCR buffer (dNTP laus, Mg²+ókeypis) | 5 | 1× |
| dUTPs (dCTP, dGTP, dATP) | - | 200 μM |
| dUTP (skipta um dTTP) | - | 200-600 μM |
| 25 mM MgCl2 | 2-8 μL | 1-4 mM |
| 5 U/μL Taq | 0,25 | 1.25 U |
| 5 U/μL UNG | 0,25 (0,1-0,5) | 0,25 U (0,1-0,5) |
| 25 × grunnblöndua | 2 | 1× |
| Sniðmát | - | ＜1μg/hvarf |
| ddH₂O | Til 50 | - |
Athugið: a: Ef það er notað fyrir qPCR/qRT-PCR, ætti að bæta flúrljómunarnemanum í hvarfkerfið.Venjulega getur endanlegur grunnstyrkur 0,2 μM gefið góða raun;þegar hvarfvirkni er léleg er hægt að stilla grunnstyrkinn á bilinu 0,2-1 μM.Venjulega er styrkur rannsakans fínstilltur á bilinu 0,1-0,3 μM.Hægt er að gera tilraunir með styrkhalla til að finna bestu samsetningu grunns og rannsaka.
Skýringar
1.Hægt er að nota UNG ensím til að fjarlægja mengaðar dUTP mögnunarafurðir úr hvarfkerfinu fyrir PCR mögnunarviðbrögðin, síðan til að forðast rangar jákvæðar niðurstöður vegna vörumengunar.
2.Ákjósanlegur hitastig fyrir UNG ensím til að nota í PCR viðbrögðum gegn mengun er yfirleitt 50 ℃ í 2 mín;óvirkjunarástandið er 95 ℃ í 5 mín.
3.Forðastu tíða frostþíðingu og ekki verða fyrir miklum hitasveiflum.
4.Mismunandi gen sem á að magna upp hafa mismunandi nýtingarvirkni á dUTP og næmi fyrir UNG ensími, þess vegna, ef notkun UNG kerfis leiðir til minnkunar á skynjunarnæmi, ætti að stilla hvarfkerfið og fínstilla, ef þú þarft tæknilega aðstoð, vinsamlegast hafðu samband við fyrirtækið okkar.
