RTL Reverse Transcriptase
RTL bakrit er RNA sniðmátháður DNA pólýmerasi sem skortir 3'→5' exonucleasa virkni og hefur RNase H virkni.Þetta ensím getur notað RNA sem sniðmát til að búa til viðbótar DNA-streng, sem hægt er að nota við myndun fyrsta strengs cDNA, sérstaklega fyrir RT-LAMP (lykkja-miðlaða ísóvarma mögnun).Í samanburði við RTL bakrit 1.0 er næmið verulega bætt, hitastöðugleiki er sterkari og hvarfið við 65°C er stöðugra.Hægt er að nota RTL bakrit (glýserólfrítt) til að útbúa frostþurrkuð efnablöndur, frostþurrkuð RT-LAMP hvarfefni o.s.frv.
Eining Skilgreining
Ein eining fellur 1 nmól af dTTP í sýruútfellanlegt efni á 20 mínútum við 50°C með því að nota poly(A)•oligo(dT)25 sem sniðmát-grunnur.
Íhlutir
| Hluti | HC5008A-01 | HC5008A-02 | HC5008A-03 |
| RTL bakrit (Glýseróllaust) (15U/μL) | 0,1 ml | 1 ml | 10 ml |
| 10×HC RTL Buffer | 1,5 ml | 4×1,5 ml | 5×10 ml |
| MgSO4 (100mM) | 1,5 ml | 2×1,5 ml | 3×10 ml |
Geymsluástand
Flutningur undir 0°C og geymdur við -25°C~-15°C.
Gæðaeftirlit
- Afgangsvirkni afEndonuclease:50 μL hvarf sem inniheldur 1 μg af λDNA og 15 einingar af RTL2.0 ræktað í 16 klukkustundir við 37 ℃ sýnir sama mynstur og neikvæða stjórn með hlauprafdrætti.
- Afgangsvirkni afExonuclease:50 μL hvarfefni sem inniheldur 1 μg af Hind Ⅲ melt λDNA og 15 einingar af RTL2.0 ræktað í 16 klukkustundir við 37 ℃ sýnir sama mynstur og neikvæða eftirlit með hlaup rafdrætti.
- Afgangsvirkni afNickase:50 μL hvarfefni sem inniheldur 1 μg af ofurspóluðu pBR322 og 15 einingar af RTL2.0 ræktaðar í 4 klukkustundir við 37°C sýnir sama mynstur og neikvæða stjórn með hlauprafdrætti.
- Afgangsvirkni afRNase:10 μL hvarf sem innihélt 0,48 μg af MS2 RNA og 15 einingar af RTL2.0 ræktað í 4 klukkustundir við 37°C sýnir sama mynstur og neikvæða stjórn með hlauprafdrætti.
- E. coli gDNA:Mælt meðE.colisértæk HCD uppgötvunarsett, 15 einingar af RTL2.0 innihalda minna en 1E. colierfðamengi.
Viðbragðsuppsetning
cDNA myndun siðareglur
| Íhlutir | Bindi |
| Sniðmát RNA a | valfrjálst |
| Oligo(dT) 18~25(50uM) eða Random Primer blanda (60uM) | 2 μL |
| dNTP blanda (10mM hver) | 1 μL |
| RNase hemill (40U/uL) | 0,5 μL |
| RTL Reverse Transcriptase 2.0 (15U/uL) | 0,5 μL |
| 10×HC RTL Buffer | 2 μL |
| Kjarnalaust vatn | Allt að 20 μL |
Athugasemdir:
1) Ráðlagður skammtur af heildar RNA er 1ng~1μg
2) Ráðlagður skammtur af mRNA var 50ng~100ng
Thermo-hjólreiðar Skilyrði fyrir rútínu viðbrögð:
| Hitastig (°C) | Tími |
| 25 °Ca | 5 mín |
| 55 °C | 10 mínb |
| 80 °C | 10 mín |
Athugasemdir:
1) Ef Random Primer Mix er notað, ræktunarskref við 25°C.
2) Ef markgrunnsblanda er notuð, ræktunarskref við 55°C í 10~30 mín.
RT-LAMP bókun
| Íhlutir | Bindi | Lokastyrkur |
| Sniðmát RNA | valfrjálst | ≥10 eintök |
| dNTP blanda (10mM) | 3,5 μL | 1,4 mM |
| FIP/BIP grunnur (25×) | 1 μL | 1,6 μM |
| F3/B3 grunnur (25×) | 1 μL | 0,2 μM |
| LoopF/LoopB grunnur (25×) | 1 μL | 0,4 μM |
| RNase hemill (40U/μL) | 0,5 μL | 20 U/Viðbrögð |
| RTL Reverse Transcriptase 2.0 (15U/μL) | 0,5 μL | 7,5 U/Viðbrögð |
| Bst V2 DNA pólýmerasi (8U/μL) | 1 μL | 8 U/Viðbrögð |
| MgSO4 (100mM) | 1,5 μL | 6 mm (samtals 8 mm) |
| 10×HC RTL Buffer (eða 10×HC Bst V2 Buffer) | 2,5 μL | 1 × (2mM Mg2+) |
| Kjarnalaust vatn | Allt að 25 μL | - |
Athugasemdir:
1) Blandið saman með því að hringsnúast og skilið í skilvindu stuttlega til að safna.Stöðug hitastig ræktun við 65°C í 1 klst.
2) Stuðpúðarnir tveir eru samvirkir og hafa sömu samsetningu.
Skýringar
1.Þessi vara myndar hvítt fast efni þegar hún er geymd við -20 °C.Takið það úr -20°C og setjið á ís í um 10 mínútur.Eftir bráðnun er hægt að nota það með því að hrista og blanda.
2.CDNA vöruna gæti verið geymt við -20°C eða -80°C eða notað strax fyrir PCR viðbrögð.
3.Til að koma í veg fyrir RNase mengun, vinsamlegast haltu tilraunasvæðinu hreinu og notaðu hreina hanska og grímur meðan á notkun stendur.
