Próteinasa K mNGS (fljótandi)
Próteinasi K er stöðugur serínpróteasi með víðtæka hvarfefnissérhæfni.Það brýtur niður mörg prótein í upprunalegu ástandi, jafnvel þegar hreinsiefni eru til staðar.Vísbendingar úr rannsóknum á kristals- og sameindabyggingu benda til þess að ensímið tilheyrir subtilisin fjölskyldunni með virka stað hvataþrenningar (Asp39-Hans69-Ser224).Ríkjandi klofningsstaður er peptíðtengi sem liggur að karboxýlhópi alífatískra og arómatískra amínósýra með stífluðum alfa amínóhópum.Það er almennt notað fyrir víðtæka sérstöðu.Þessi próteinasi K er sérstaklega hannaður fyrir mNGS.Samanborið við hinn próteinasann K inniheldur hann enn minni kjarnsýrumengun með sömu ensímvirkni, sem gæti betur tryggt mNGS-innstreymisnotkunina.
Geymsluskilyrði
2-8 ℃ í 2 ár
Forskrift
| Útlit | Litlaus til ljósbrúnn vökvi |
| Virkni | ≥800 U/ml |
| Próteinstyrkur | ≥20 mg/ml |
| Nickase | Ekkert fannst |
| DNasi | Ekkert fannst |
| RNase | Ekkert fannst |
Eiginleikar
| EB númer | 3.4.21.64(Rannbrigðaefni úr Tritirachium plötu) |
| Isoelectric punktur | 7,81 |
| Besta pH | 7.0- 12.0 Mynd 1 |
| Ákjósanlegur hiti | 65 ℃ Mynd 2 |
| pH stöðugleiki | pH 4,5- 12,5 (25 ℃, 16 klst.) Mynd 3 |
| Hitastöðugleiki | Undir 50 ℃ (pH 8,0, 30 mín) Mynd 4 |
| Geymslustöðugleiki | Yfir 90% virkni í 12 mánuði við 25 ℃ |
| Virkjarar | SDS, þvagefni |
| Hindrar | Díísóprópýl flúorfosfat;fenýlmetýlsúlfónýlflúoríð |
Umsóknir
1. Erfðagreiningarsett
2. RNA og DNA útdráttarsett
3. Útdráttur ópróteinþátta úr vefjum, niðurbrot próteinóhreininda, svo sem DNAbóluefni og undirbúningur heparíns
4. Undirbúningur á litninga DNA með púls rafdrætti
5. Vesturblettur
6. Ensím glýkósýleruð albúmín hvarfefni in vitro greining
Varúðarráðstafanir
Notið hlífðarhanska og hlífðargleraugu við notkun eða vigtun og haldið vel loftræstum eftir notkun.Þessi vara getur valdið ofnæmisviðbrögðum í húð og alvarlegri ertingu í augum.Ef það er andað inn getur það valdið ofnæmis- eða astmaeinkennum eða mæði.Getur valdið ertingu í öndunarfærum.
Skilgreining eininga
Ein eining (U) er skilgreind sem magn ensíms sem þarf til að vatnsrjúfa kasein til að framleiða 1 míkrómóltýrósín á mínútu við eftirfarandi aðstæður.
Undirbúningur hvarfefna
Hvarfefni I: 1 g mjólkurkasein var leyst upp í 50 ml af 0,1M natríumfosfatlausn (pH 8,0), ræktað í 65-70 ℃ vatni í 15 mínútur, hrært og leyst upp, kælt með vatni, stillt með natríumhýdroxíði í pH 8,0 og fast rúmmál 100ml.
Hvarfefni II: 0,1M tríklórediksýra, 0,2M natríumasetat, 0,3M ediksýra.
Hvarfefni III: 0,4M Na2CO3lausn.
Hvarfefni IV: Forint hvarfefni þynnt með hreinu vatni í 5 sinnum.
Hvarfefni V: Ensímþynningarefni: 0,1M natríumfosfatlausn (pH 8,0).
Hvarfefni VI: týrósínlausn: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 umól/ml týrósín uppleyst með 0,2M HCl.
Málsmeðferð
1. 0,5 ml af hvarfefni I er forhitað í 37 ℃, bætið við 0,5 ml af ensímlausn, blandið vel saman og ræktið kl.37 ℃ í 10 mín.
2. Bætið 1 ml af hvarfefni II við til að stöðva hvarfið, blandið vel saman og haltu áfram ræktun í 30 mínútur.
3. Miðflótta hvarflausn.
4. Taktu 0,5 ml flot, bættu við 2,5 ml hvarfefni III, 0,5 ml hvarfefni IV, blandaðu vel saman og ræktaðu við 37 ℃í 30 mín.
5. OD660var ákvarðað sem OD1;blankur samanburðarhópur: 0,5ml hvarfefni V er notað til að skipta um ensímlausn til að ákvarða OD660sem OD2, OD=OD1-OD2.
6. L-týrósín staðalferill: 0,5 ml mismunandi styrkur L-týrósín lausn, 2,5 ml hvarfefni III, 0,5 ml hvarfefni IV í 5 ml skilvindu rör, ræktað í 37 ℃ í 30 mínútur, greint fyrir OD660fyrir mismunandi styrk L-týrósíns, fékk þá staðalferilinn Y=kX+b, þar sem Y er styrkur L-týrósíns, X er OD600.
Útreikningur
2: Heildarrúmmál hvarflausnar (mL)
0,5: Rúmmál ensímlausnar (ml)
0,5: Rúmmál hvarfvökva notað við litningaákvörðun (mL)
10: Viðbragðstími (mín.)
Df: Margföld þynning
C: Ensímstyrkur (mg/ml)
Heimildir
1. Wieger U & Hilz H. FEBS Lett.(1972);23:77.
2. Wieger U & Hilz H. Biochem.Lífeðlisfræði.Res.Samfélag.(1971);44:513.
3. Hilz, H.o.fl.,Eur.J. Biochem.(1975);56:103–108.
4. Sambrook Jet al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. útgáfa, Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor (1989).
Tölur
Mynd.1 Ákjósanlegur pH
100mM jafnalausn: pH 6,0-8,0, Na-fosfat;pH 8,0-9,0, Tris-HCl;pH9,0-12,5, Glycine-NaOH.Ensímstyrkur:1mg/ml
Mynd.2 Kjörhiti
Hvarf í 20 mM K-fosfat buffer pH 8,0.Ensímstyrkur: 1 mg/ml
Mynd.3 pH Stöðugleiki
25 ℃, 16 klst. meðferð með 50 mM jafnalausn: pH 4,5-5,5, asetat;pH 6,0-8,0, Na-fosfat;pH 8,0-9,0, Tris-HCl.pH 9,0-12,5, Glýsín-NaOH.Ensímstyrkur: 1 mg/ml
Mynd.4 Hitauppstreymi stöðugleika
30 mín meðferð með 50 mM Tris-HCl jafnalausn, pH 8,0.Ensímstyrkur: 1 mg/ml
Mynd.5 Geymsla stöðugleikaty at 25℃
