Próteinasa K NGS (duft)
Vörunúmer: HC4507A
NGS próteasi K er stöðugur serínpróteasi með mikla ensímvirkni og breitt hvarfefnissérhæfni. Ensímið brýtur helst niður estertengi og peptíðtengi sem liggja að C-enda vatnsfælna amínósýra, amínósýra sem innihalda brennistein og arómatískar amínósýrur.Svo er það oft notað til að brjóta niður prótein í stutt peptíð.NGS Protease K er dæmigerður serínpróteasi með Asp39-Hans69-Ser224hvatandi þríhyrningur sem er einstakur fyrir serínpróteasa, og hvarfamiðstöðin er umkringd togi Ca2+bindistaðir fyrir stöðugleika, viðhalda mikilli ensímvirkni við fjölbreyttari aðstæður.
Forskrift
| Útlit | Hvítt til beinhvítt formlaust duft, frostþurrkað |
| Sérstök starfsemi | ≥40U/mg fast efni |
| DNasi | Ekkert fannst |
| RNase | Ekkert fannst |
| Lífbyrði | ≤50CFU/g fast efni |
| Kjarnsýruleifar | <5pg/mg fast efni |
Eiginleikar
| Heimild | Tritirachium albúm |
| EB númer | 3.4.21.64(Rannbrigðaefni úr Tritirachium plötu) |
| Mólþungi | 29kDa (SDS-PAGE) |
| Isoelectric punktur | 7.81 Mynd.1 |
| Besta pH | 7.0-12.0 (Allir framkvæma mikla virkni) Mynd.2 |
| Ákjósanlegur hiti | 65℃ Mynd 3 |
| pH Stöðugleiki | pH 4,5-12,5 (25℃,16klst.) Mynd 4 |
| Hitastöðugleiki | Undir 50 ℃ (pH 8,0, 30 mín) Mynd.5 |
| Geymslustöðugleiki | Geymt við 25 ℃ í 12 mánuði. Mynd 6 |
| Virkjarar | SDS, þvagefni |
| Hindrar | Díísóprópýl flúorfosfat;bensýlsúlfónýl flúoríð |
Geymsluskilyrði
Geymið frostþurrkaða duftið við -25~-15 ℃ í langan tíma fjarri ljósi;Eftir upplausn, deilið í viðeigandi magn til skammtímageymslu við 2-8 ℃ fjarri ljósi eða langtímageymslu við -25~-15 ℃ fjarri ljósi.
Varúðarráðstafanir
Notið hlífðarhanska og hlífðargleraugu við notkun eða vigtun og haldið vel loftræstum eftir notkun.Þessi vara getur valdið ofnæmisviðbrögðum í húð og alvarlegri ertingu í augum.Ef það er andað inn getur það valdið ofnæmis- eða astmaeinkennum eða mæði.Getur valdið ertingu í öndunarfærum.
Skilgreining eininga
Ein eining af NGS próteasa K er skilgreind sem magn ensíms sem þarf til að vatnsrjúfa kasein í 1 míkrómól L-týrósíns við staðlaðar ákvarðanir.
Undirbúningur hvarfefna
| Hvarfefni | Framleiðandi | Vörulisti |
| Kasein tæknilegúr nautgripamjólk | Sigma Aldrich | C7078 |
| NaOH | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10019762 |
| NaH2PO4·2H2O | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 20040718 |
| Na2HPO4 | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 20040618 |
| Tríklórediksýra | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 80132618 |
| Natríum asetat | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10018818 |
| Ediksýra | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10000218 |
| HCl | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10011018 |
| Natríumkarbónat | Sinopharm ChemicalReagent Co., Ltd. | 10019260 |
| Fólín-fenól | Sangon Biotech (Shanghai)Co., Ltd. | A500467-0100 |
| L-týrósín | Sigma | 93829 |
Hvarfefni I:
Undirlag: 1% kasein úr nautgripamjólkurlausn: leyst upp 1 g nautgripakaseín í 50 ml af 0,1M natríumfosfatlausn, pH 8,0, hitað í vatnsbaði við 65-70 °C í 15 mínútur, hrært og leyst upp, kælt með vatni, stillt með natríumhýdroxíð að pH 8,0 og þynnt í 100ml.
Hvarfefni II:
TCA lausn: 0,1M tríklórediksýra, 0,2M natríumasetat og 0,3M ediksýra (vegið 1,64g tríklórediksýra + 1,64g natríumasetat + 1,724mL ediksýra í röð, bætið 50mL afjónuðu vatni í röð, bætið 50mL afjónuðu vatni út í, stillið með HCl, 4. 100 ml).
Hvarfefni III:
0,4m natríumkarbónatlausn (vigtu 4,24g vatnsfrítt natríumkarbónat og leyst upp í 100mL vatni)
Hvarfefni IV:
Fólínfenól hvarfefni: þynnt 5 sinnum með afjónuðu vatni.
Hvarfefni V:
Ensímþynningarefni: 0,1 M natríumfosfatlausn, pH 8,0.
Hvarfefni VI:
L-týrósín staðallausn: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 umól/ml L-týrósín leyst upp með 0,2M HCl.
Málsmeðferð
1. Kveiktu á UV-Vis litrófsmælinum og veldu ljósmælingu.
2. Stilltu bylgjulengdina sem 660nm.
3. Kveiktu á vatnsbaðinu, stilltu hitastigið á 37 ℃, tryggðu að hitastigið sé óbreytt í 3-5 mín.
4. Forhitaðu 0,5 ml undirlag í 2 ml skilvinduröri við 37 ℃ vatnsbað í 10 mínútur.
5. Dragðu 0,5 ml af þynntri ensímlausn út í forhitaða skilvindurörið í 10 mínútur.Stilltu ensímþynningarefni sem auðan hóp.
6. Bætið við 1,0 ml TCA hvarfefni strax eftir hvarfið.Blandið vel saman og ræktið í vatnsbaði í 30 mínútur.
7. Miðflótta hvarflausn.
8. Bættu við eftirfarandi hlutum í þeirri röð sem tilgreind er.
| Hvarfefni | Bindi |
| Flotvatn | 0,5 ml |
| 0,4M natríumkarbónat | 2,5 ml |
| Folin phenol hvarfefni | 0,5 ml |
9. Blandið vel saman áður en það er ræktað í vatnsbaði við 37 ℃ í 30 mínútur.
10. OD660var ákvarðað sem OD1;blankur samanburðarhópur: Ensímþynningarefni er notað til að skipta um ensímlausn til að ákvarða OD660sem OD2, OD=OD1-OD2.
11. L-týrósín staðalferill: 0,5 ml mismunandi styrkur L-týrósín lausn, 2,5 ml 0,4M natríumkarbónat, 0,5 ml af fólín fenól hvarfefni í 5 ml skilvindu rör, ræktað í 37 ℃ í 30 mínútur, greina fyrir OD660fyrir mismunandi styrk L-týrósíns, þá fékkst staðalferillinn Y=kX+b, þar sem Y er styrkur L-týrósíns, X er OD600.
Útreikningur
2: Heildarrúmmál hvarflausnar (mL)
0,5: Rúmmál ensímlausnar (ml)
0,5: Rúmmál hvarfvökva notað við litningaákvörðun (mL)
10: Viðbragðstími (mín.)
Df: Margföld þynning
C: Ensímstyrkur (mg/ml)
Tölur
Mynd 1 DNA leifar
| Sýnishorn | Ave C4 | Kjarnsýra Endurheimt (bls/mg) | Endurheimt (%) | Algjör kjarni Sýra ( bls/mg) |
| PRK | 24,66 | 2.23 | 83% | 2.687 |
| PRK+STD2 | 18.723 | 126.728 | — | — |
| STD1 | 12.955 |
— |
— |
— |
| STD2 | 16 | |||
| STD3 | 19.125 | |||
| STD4 | 23.135 | |||
| STD5 | 26.625 | |||
| RNA-frítt H2O | Óákveðið | — | — | — |
Mynd.2 Besta pH
Mynd.3 Kjörhiti
Mynd.4 pH Stöðugleiki
Mynd.5 Hitastöðugleiki
Mynd 6 Geymslustöðugleiki við 25 ℃
