EndoFree Plasmid Maxi Kit

Geymsluskilyrði

RNaseA skal geyma við -30 ~ -15 ℃ og flytja við ≤0 ℃.

Endotoxin Scavenger er hægt að geyma við 2 ~ 8 ℃ í einn mánuð, geymt við -30 ~ -15 ℃ fyrir langtíma geymsluog flutt við ≤0 ℃.

Aðra íhluti ætti að geyma við stofuhita (15 ~ 25 ℃) og flytja við stofuhita.

Íhlutir

RNaseA:10 mg/ml, notað til að fjarlægja RNA.

Buffer P1:bakteríusviflausn, bætið RNaseA við Buffer P1 fyrir fyrstu notkun.

Buffer P2:bakteríulýsubuffi (inniheldur SDS/NaOH).

Buffer P4:hlutleysandi biðminni.

Endotoxin Scavenger:fjarlægja endotoxín á áhrifaríkan hátt úr hráu plasmíðþykkni.

Buffer PW:þvottapúði, bætið tilskildu magni af etanóli við fyrir fyrstu notkun.

Buffer TB:skolunarbuffi.

FastPure DNA Maxi dálkar:plasmíð DNA aðsogssúlur.

Söfnunarrör 50 ml:söfnunarrör fyrir síuvökva.

Endotoxínlaust söfnunarglas:söfnunarrör fyrir plasmíð DNA.

Undirbúið efni

Algert etanól, ísóprópanól, 50 ml hringbotna skilvindurör og 50 ml endotoxínfríttskilvindurör.

Umsóknir

Þessi vara er hentug til útdráttar plasmíða í stórum stíl úr 150 - 300 ml af bakteríulausnræktað yfir nótt.

Tilraunaferli

1. Takið 150 – 200 ml (ekki meira en 300 ml) af bakteríulausn sem er ræktuð yfir nótt og skilið kl.um 11.000 snúninga á mínútu (12.000 × g) í 1 – 2 mín.Fleygðu flotinu og safnaðu bakteríum.

Δ Þegar safnað er meira en 50 ml af bakteríulausn er hægt að safna bakteríunum með því að bæta við bakteríulausn, skilvindu, fleygja flotinu og öðrum skrefum í sama 50 ml túpunni fyrir

mörgum sinnum.

2. Bætið 7,5 ml af Buffer P1 (vinsamlegast athugaðu hvort RNaseA hafi verið bætt við Buffer P1) í skilvindunatúpu sem inniheldur bakteríur og blandið vandlega saman með hvirfli eða pípettingu.

Δ Fullkomin endurblöndun baktería í þessu skrefi er mikilvæg til að gefast og það ætti ekki að vera bakteríuklumpur eftir endurblöndun.Ef það eru bakteríuklumpar sem eru ekki vandlega blandaðir mun það hafa áhrif á leysinguna, sem leiðir til lítillar uppskeru og hreinleika.Ef OD600 bakteríulausn er 0,65 er mælt með því að nota 7,5 ml af Buffer P1 þegar dreginn er út úr 150 ml af bakteríulausn;þegar OD600 er 0,75, ætti að nota 8 ml af Buffer P1 og breyta rúmmáli Buffer P2 og P4 í samræmi við það.Ef rúmmál bakteríulausnarinnar er aukið í 200 ml er mælt með því aðrúmmál stuðpúða P1, P2 og P4 aukið hlutfallslega.

3. Bætið 7,5 ml af Buffer P2 við bakteríusviflausnina frá skrefi 2 og blandið varlega upp og niður í 6 – 8sinnum og ræktað við stofuhita í 4 – 5 mín.

Δ Hvolfið varlega til að blanda vel saman.Vortexing mun valda erfðamengi DNA sundrun, sem leiðir til erfðafræðilegra DNA brota í útdregnu plasmíði.Á þessum tíma verður lausnin seigfljótandi og hálfgagnsær, sem sýnir að bakteríurnar hafa verið að fullu leystar.Lengd þess ætti ekki að vera lengri en 5 mínútur til að forðast eyðingu plasmíðanna.Ef lausnin er ekki tær geta of margar bakteríur valdið þvíófullnægjandi lýsi, þannig að magn baktería ætti að minnka á viðeigandi hátt.

4. Bætið 7,5 ml af Buffer P4 við bakteríusviflausnina frá skrefi 3 og hvolfið strax varlega 6 – 8 sinnum til að leyfa lausninni að hlutleysa Buffer P2 alveg.Á þessum tíma ætti hvítt flocculent botnfall að koma fram.Miðflótta við meira en um það bil 11.000 snúninga á mínútu (12.000 × g) í 10 – 15 mínútur, píptu ofanvatninu varlega í nýtt 50 ml hringbotna skilvindurör (sjálfútbúið) og forðastusogið upp fljótandi hvíta botnfallinu.

Δ Bætið við Buffer P4 og hvolfið strax til að blanda vel saman.Látið rörið standa þar til hvíta botnfallið er dreift jafnt um lausnina til að koma í veg fyrir að staðbundin úrkoma myndist sem gæti haft áhrif á hlutleysingu.Ef ekkert einsleitt hvítt flókandi botnfall er fyrir skiljun og flotið er ekki tært eftir skiljun, máskilið í skilvindu í aðrar 5 mín.

5. Bætið 0,1 sinnum rúmmálinu (10% af rúmmáli flotans, um 2,2 ml) af Endotoxin Scavenger við flotið frá skrefi 4 og hvolfið til að blanda.Settu lausnina í ísbað eða settu í mulinn ís (eða kælifrysti) í 5 mínútur þar til lausnin breytist úr gruggugri í tær og gegnsær (eða ennörlítið gruggugt), og blandið stundum nokkrum sinnum.

Δ Eftir að Endotoxin Scavenger er bætt við flotið verður flotið gruggugt enflotið ætti að verða tært (eða örlítið gruggugt) eftir kælingu í ísbaðinu.

6. Eftir að flotið er komið fyrir við stofuhita (>25 ℃) í 10 – 15 mínútur verður það gruggugt þar semhitastig þess hækkar í stofuhita.Síðan ætti að hvolfa ofanvatninu til að blandast saman.

Δ Ef stofuhiti er lægri eða þú vilt stytta útdráttartíma er hægt að rækta flotið í 37 ~ 42 ℃ vatnsbaði í 5 – 10 mínútur og næsta skref er hægt að framkvæma á eftir flotinuverður gruggugt.

7. Sendið flotið við um það bil 11.000 snúninga á mínútu (12.000 × g) í 10 mínútur við stofuhita (hitastig verður að vera >25 ℃) til að aðskilja fasann.Efri vatnsfasinn inniheldur DNA á meðan neðra bláa olíufasalagið inniheldur endotoxín og önnur óhreinindi.FlytjaVatnsfasa sem inniheldur DNA til nýrrar rörs ogfargaðu olíulaginu.

Δ Hitastigið við skilvindu verður að vera yfir 25 ℃ þar sem virkur fasaaðskilnaður gerir það ekkieiga sér stað ef hitastigið er of lágt.

Δ Ef fasaskilnaður er ekki árangursríkur er hægt að stilla skilvinduhitastigið í 30 ℃ ogHægt er að auka skilvindutímann í 15 mín.

Δ Ekki sjúga bláa olíulagið þar sem það inniheldur endotoxín og önnur óhreinindi.

Vélbúnaður

Endurupplausn Lysis Hlutleysing

◇ Bætið við 7,5 ml buffer P1

◇ Bætið við 7,5 ml buffer P2

◇ Bætið við 7,5 ml buffer P4

Fjarlæging endotoxins

◇Bætið við 0,1 sinnum magni flotans af Endotoxin Scavenger

Binding og þvottur

◇ Bætið við 0,5 sinnum rúmmáli ísóprópanóls

◇ Bætið við 10 ml buffer PW