Plöntu beint PCR Kit

Vörunúmer: HCR2020A

Plant Direct PCR Kit er hentugur fyrir beina mögnun á plöntulaufum, fræjum o.s.frv., og er hægt að nota til skimunar með miklum afköstum á plöntusýnum sem innihalda ekki fjölsykrur og fjölfenól.Bein mögnunar DNA pólýmerasi sem byggir á stýrðri þróun hefur yfirburða þol fyrir PCR hemlum í plöntum.Á meðan heldur það háum mögnunarafköstum, sem hentar til mögnunar á DNA brotum innan 5 kb.Hægt er að nota einstaka Lysis buffer A í settinu til að greina ferskan eða frosinn plöntuvef.Það er auðvelt í notkun og lýsatið er hægt að nota sem sniðmát fyrir mögnun án hreinsunar.Kerfið inniheldur hlífðarefni sem gera kleift að magna hrásýni á áhrifaríkan hátt eftir endurtekna frystingu og þíðingu.2 × Plant Direct Master Mix þarf aðeins að bæta við grunni og sniðmátum til að framkvæma mögnunarviðbrögð, þannig að draga úr píptuaðgerðum og bæta greiningarafköst og endurtakanleika niðurstaðna.

Íhlutir

*Plant Direct Lysis Buffer B er valfrjálst hvarfefni, sem er notað til að hlutleysa Plant Direct Lysis Buffer A til að lengja geymslutíma sýna.Það er hægt að nota í samræmi við raunverulegar aðstæður.

Geymsluskilyrði

2 × Plant Direct Master Mix, geymdu við -30 ~ -15 ℃ og forðastu endurtekna frystingu og þíðingu;Plant Direct Lysis Buffer, geymdu við -30 ~ -15 ℃ eða 2 ~ 8 ℃.

Tilraunaferli

Sýnisvinnsla–Plöntublað

Bein aðferð:Mælt er með því að nota ung laufblöð.Notaðu gata með föstu þvermáli 0,5 – 3 mm til að fá lítið og einsleitt sýni og bættu síðan sýninu beint við PCR kerfið (mælt er með 50 μl kerfi).Athugið, gakktu úr skugga um að sýnishornið sé í PCR lausninni og ekki á móti rörveggnum.Ef beinn PCR er notaður til að magna upp löng brot og flókin sýni getur það hjálpað til við að ná betri árangri með því að nota sýni með minni þvermál (0,5 – 1 mm) sem sniðmát.

Mala lysis aðferð:Mælt er með því að nota ung laufblöð.Taktu lítið blaðastykki (um það bil 1 – 3 mm í þvermál), settu það í 20 μl Plant Direct Lysis Buffer Ab og malaðu það eins mikið og mögulegt er (þetta skref er hægt að gera með því að kreista blaðið með 100 μl pípettuodda að mauka sýnið).Ef notað er meira magn af blaðvef (ekki meira en 7 mm), aukið rúmmál þynningarjafnaðar í 50 μl.Eftir að blöðin eru möluð ætti lausnin að vera græn.Eftir stutta skilvindu er 1 μl af flotinu bætt við PCR kerfið sem hvarfsniðmát.

Hitagreiningaraðferð:Mælt er með því að nota ung laufblöð.Taktu lítið blað (um 1 – 3 mm í þvermál), settu það í 20 μl Plant Direct Lysis Buffer A og hitaðu það við 95°C í 5 – 10 mín.Hægt er að lengja ljósatímann á viðeigandi hátt fyrir lauf sem erfitt er að greina (ekki meira en 20 mín).Ef notað er meira magn af blaðvef (ekki meira en 7 mm), aukið rúmmál þynningarjafnaðar í 50 μl.Eftir upphitun, skilið í skilvindu stuttlega og bætið 1 μl af floti í PCR kerfið sem hvarfsniðmát.

Sýnisvinnsla- Plöntufræ

Mala lysis aðferð:Notaðu skurðhníf til að skera fræ með 5 mm þvermál, bætið þeim við 100 μl af Plant Direct Lysis Buffer A og malið sýnið með pípettuodda eða öðrum verkfærum.Hringdu í stutta stund og láttu standa við stofuhita í 3 – 5 mín.Gakktu úr skugga um að fræsýnið sé á kafi í þynningarjafna.Eftir stutta skilvindu skaltu bæta 1 μl af flotinu við PCR kerfið sem hvarfsniðmát.

Hitagreiningaraðferð:Notaðu skurðhníf til að skera fræ með 5 mm þvermál, bætið þeim við 100 μl af Plant Direct Lysis Buffer A og hitið við 95°C í 5 – 10 mín.Hægt er að lengja ljósatímann á viðeigandi hátt fyrir lauf sem erfitt er að rjúfa (ekki meira en 30 mín).Eftir upphitun, skilið stuttlega í skilvindu og bætið 1 μl floti í PCR kerfið sem hvarfsniðmát.

a.Einnig er hægt að nota skæri eða önnur verkfæri til að klippa sýni af viðeigandi stærð;ef kýla eða skæri eru endurnotuð skal hreinsa þau með 2% natríumhýpóklórítlausn fyrir hverja notkun til að koma í veg fyrir krossmengun á milli sýna.

b.Gakktu úr skugga um að beinn lýsisbufferinn sé að fullu bráðinn fyrir notkun.Ef stuðpúðinn er seigfljótandi eða hefur útfellingar má hita hann við 37 ℃ til að bræða hann alveg fyrir notkun.

c.Rúmmál sniðmáts í hvarfkerfinu er hægt að stilla á viðeigandi hátt í samræmi við muninn á rúmmáli plöntuefnis og þynningarefnis sem bætt er við.

Plant Bein Lysis Buffer

Plant Direct Lysis Buffer A sem er í þessari vöru hefur verið stranglega fínstillt til að losa erfðamengi flestra plöntuvefja og er hentugur til skammtímageymslu á hráum plöntum við 4 ℃.Ef geyma þarf sýnið í lengri tíma (td 1 – 2 mánuði) er mælt með því að flytja flotið yfir í nýtt EP-glas og geyma það við -20 ℃.Til að geyma sýnin stöðugri, bætið jöfnu rúmmáli af Plant Direct Lysis Buffer B við yfirflutt flotið, blandið vel saman og geymið við -20 ℃.Stöðugur geymslutími er breytilegur eftir sýnum og ástandi plantna.

Viðbragðskerfi

a.Það inniheldur Mg²⁺við lokastyrk 2 mM.

b.Mælt er með því að nota lokastyrk upp á 0,4μM fyrir hvern grunn.Óhófleg notkun primers mun leiða til aukinnar ósértækrar mögnunar.

c.Hægt er að stilla magn sýnis sem notað er í samræmi við raunverulegar aðstæður.Magnið sem notað er í einni hvarf af hráu lýstu sýni er hægt að stilla á milli 2% - 20% af heildarrúmmáli hvarfsins.Notkun of mikið af sýnum getur valdið mögnunarbilun.

Viðbragðsáætlun

a.Upphafsdenaturation (98 ℃, 5 mín) stuðlar að leysingu á plöntuvef, losar erfðafræðilegt DNA sem hægt er að nota til PCR mögnunar.Ekki stytta tímann eða minnka hitastigið.

b.Mælt er með því að stilla það jafnt og Tm gildi grunnsins eða 2 ~ 4 ℃ hærra en Tm gildið.Bein mögnunar-DNA-pólýmerasi sem notaður er í þessari vöru er frábrugðinn hefðbundnum Taq DNA-pólýmerasa og hefur sérstakar kröfur um viðbragðshitastigið; notkun hás hitastigs getur í raun dregið úr ósértækri mögnun og bætt mögnunarskilvirkni.Fyrir flókin sniðmát er hægt að ná fram skilvirkri mögnun með því að stilla hitastig glæðingar og lengja framlengingartímann.

c.Ef lengd mögnunarafurðarinnar er ≤1 kb er framlengingartíminn stilltur á 30 sek/kb;ef lengd mögnunarafurðarinnar er >1 kb er framlengingartíminn stilltur á 60 sek/kb.

d.Fyrir flókin sýni eða sýni með lágt mögnunarafrakstur er hægt að auka fjölda lota á viðeigandi hátt í 40 -50 lotur.

Umsóknir

Það á við um beina mögnun á plöntuvef og skimun með miklum afköstum á plöntusýnum sem innihalda ekki fjölsykrur og fjölfenól.

Skýringar

Aðeins til rannsóknarnota.Ekki til notkunar í greiningaraðferðum.

1. Fyrir grófa plöntumögnun eða beina mögnun er mælt með því að nota hreinsað erfðafræðilegt DNA sem jákvæðan samanburð áður en tilraunin er hafin til að tryggja að kerfið, grunnur og aðgerðir séu rétt.

2. Bein mögnunar DNA pólýmerasi sem notaður er í þessu setti hefur sterka prófarkalestur.Ef framkvæma þarf TA klónun er mælt með því að hreinsa DNA áður en adeníninu er bætt við.

3. Leiðbeiningar um grunnhönnun:

a.Mælt er með því að síðasti basinn í 3′ enda grunnsins sé G eða C.

b.Forðast skal ósamræmi í röð í síðustu 8 bösunum við 3′ enda grunnsins.c.Forðastu hárnálabyggingar við 3′ enda grunnsins.

d.Mismunur á Tm-gildi framvirka grunnsins og afturábaks grunnsins ætti ekki að vera meiri en 1 ℃ og Tm-gildið ætti að vera stillt í 60 ~ 72 ℃ (Mælt er með Primer Premier 5 til að reikna út Tm-gildið).

e.Auka viðbótar grunnröð sem passa ekki við sniðmátið ætti ekki að vera með þegar Tm gildi grunnsins er reiknað út.

f.Mælt er með því að GC innihald grunnsins sé 40% -60%.

g.Heildardreifing A, G, C og T í grunninum ætti að vera eins jöfn og hægt er.Forðastu að nota svæði með hátt GC eða AT innihald.

h.Forðastu tilvist complementary raðir af 5 eða fleiri basum annaðhvort innan primersins eða á milli tveggja primera og forðast tilvist sambótaraðar 3 eða fleiri basa í 3′ enda tveggja primera.

i.Notaðu NCBI BLAST aðgerðina til að athuga sérhæfni primersins til að koma í veg fyrir ósértæka mögnun.