M-MLV bakrit
RevScript Reverse transcriptasi er fenginn með erfðatækni.Það hefur meiri cDNA myndun getu, hitastöðugleika og viðbragðshitamörk (allt að 60°C).Tilbúna cDNA afurðin er allt að 10 kb.Það eykur sækni sniðmátanna og er hentugur fyrir öfuga umritun á RNA sniðmátum með flókinni aukabyggingu eða lágum afritunargenum.
Íhlutir
| Hluti | HC2003B-01 (10.000U) | HC2003B-02 (5*10.000U) | HC2003B-03 (200.000U) |
| RevScript bakrit (200U/μL) | 50 μL | 5×50 μL | 1 ml |
| 5 × RevScript biðminni | 250 μL | 1,25 ml | 5 ml |
Geymsluástand
Þessa vöru á að geyma við -25°C~-15°C í 2 ár.
Eining Skilgreining
Ein eining inniheldur 1 nmól af dTTP í sýruóleysanlegt efni á 10 mínútum við 37°C með því að nota Oligo(dT) sem grunnur.
Viðbragðsuppsetning
1. Afeitrun RNA sniðmáts (Þetta skref er valfrjálst, eðlisbreyting á RNA sniðmáti hjálpar til við að opna aukabyggingar, sem mun bæta afrakstur fyrsta strengs cDNA.)
| Íhlutir | Rúmmál (μL) |
| RNase laus ddH2O | Til 13 |
| Óligo(dT)18 (50 μmól/L) eða Random Primer (50 μmól/L) Eða genasértækir grunnur (2 μmól/L) | 1 |
| eða 1 | |
| eða 1 | |
| RNA sniðmát | Xa |
Athugasemdir:
1) a: Heildar-RNA: 1-5 ug eða mRNA: 1-500 ng
2) Ræktað við 65°C í 5 mínútur, síðan flutt á ís strax til að kæla í 2 mínútur.Stutt skilvindu til að safna hvarfvökva, bætið við öfugumritunarhvarflausninni eins og sýnt er í eftirfarandi töflu.Pípettaðu varlega til að blanda saman.
1. Undirbúningur hvarfblöndunnar (20 μL rúmmál)
| Íhlutir | Rúmmál (μL) |
| Blanda af fyrra þrepi | 13 |
| 5×Buffer | 4 |
| dNTP blanda (10nmól/L) | 1 |
| Reverse Transcriptase (200 U/μL) | 1 |
| RNase hemill (40 U/μL) | 1 |
1.Framkvæmdu hvarfið við eftirfarandi aðstæður:
| Hitastig (°C) | Tími |
| 25 °Ca | 5 mín |
| 42°Cb | 15-30 mín |
| 85°Cc | 5 mín |
Athugasemdir:
1) a.Ræktun við 25°C í 5 mínútur er aðeins nauðsynleg til að nota handahófskennda hexamerana.Vinsamlegast slepptu þessu skrefi þegar þú notar Oligo (dT)18eða Gene Specific Primer.
2) b.Ráðlagður hitastig um öfugt umritun er 42°C. Fyrir sniðmát með flókna aukabyggingu eða hátt GC innihald er mælt með því að hækka hvarfhitastigið í 50-55°C.
3) c.Upphitun við 85°C í 5 mínútur til að óvirkja bakrit.
4) Hægt er að nota vöruna beint í PCR eða qPCR viðbrögð, eða geyma við -20°C til skammtímageymslu.Mælt er með því að samræma vörurnar og geyma við -80°C til langtímageymslu.Forðist tíða frost-þíðingu.
5) Varan er hentug fyrir eins þrepa RT-qPCR, mælt er með því að bæta við 10-20 U bakriti fyrir hvert 25μL hvarfkerfi, eða auka smám saman magn bakrits í samræmi við raunverulegar aðstæður.
Skýringar
1.Vinsamlegast haltu tilraunasvæðinu hreinu;Nota skal hreina hanska og grímur meðan á notkun stendur.Allar rekstrarvörur sem notaðar eru í tilrauninni ættu að vera RNase-lausar til að koma í veg fyrir RNase-mengun.
2. Allar aðgerðir ættu að fara fram á ís til að koma í veg fyrir niðurbrot RNA.
3. Mælt er með hágæða RNA sýnum til að tryggja mikla skilvirkni í öfugri umritun.
4.Þessi vara er eingöngu til rannsóknarnotkunar.
5.Vinsamlegast notaðu rannsóknarfrakka og einnota hanska, til öryggis.
