M-MLV Neoscript Reverse Transcriptase
Neoscript Reverse Transcriptase er öfug umskrift sem fæst með stökkbreytingarskimun á M-MLV geninu af uppruna Moloney músahvítblæðisveiru og tjáningu í E.coli.Ensímið fjarlægir RNase H virkni, hefur hærra hitaþol og er hentugur fyrir öfuga umritun við háan hita.Þess vegna er það gagnlegt til að útrýma óhagstæðum áhrifum RNA-hástigsbyggingarinnar og ósértækra þátta á cDNA nýmyndun og hefur meiri stöðugleika og öfuga umritunargetu.Ensímið hefur meiri stöðugleika og öfuga umritunargetu.
Íhlutir
1.200 U/μL Neoscript Reverse Transcriptase
2.5 × First-Strand buffer (valfrjálst)
* 5 × First-Strand Buffer inniheldur ekki dNTP, vinsamlegast bættu við dNTP þegar þú undirbýr viðbragðskerfið
Mælt er með umsókn
1.Eitt skref qRT-PCR.
2.RNA veiru uppgötvun.
Geymsluástand
-20°C til langtímageymslu, ætti að blanda vel saman fyrir notkun, forðast tíða frost-þíðingu.
Eining Skilgreining
Ein eining inniheldur 1 nmól af dTTP á 10 mínútum við 37°C með því að nota poly(A)•oligo(dT)25sem sniðmát/grunnur.
Gæðaeftirlit
1.SDS-PAGE rafhleðsluhreinleiki meiri en 98%.
2.Mögnunarnæmi, lotu-til-lotu stjórnun, stöðugleiki.
3.Engin utanaðkomandi núkleasavirkni, engin utanaðkomandi endónukleasa eða exonucleasa mengun
Viðbragðsuppsetning fyrir fyrstu keðjuverkunarlausn
1.Undirbúningur hvarfblöndunnar
| Íhlutir | Bindi |
| Óligo(dT)12-18 Grunnur eða Random Primera Eða genasértækir grunnurb | 50 pmol |
| 50 pmol (20-100 pmol) | |
| 2 pmol | |
| 10 mM dNTP | 1 μL |
| Sniðmát RNA | Heildar-RNA≤ 5μg;mRNA≤ 1 μg |
| RNase-frítt dH2O | Til 10 μL |
Athugasemdir:a/b: Vinsamlegast veldu mismunandi gerðir af primers í samræmi við tilraunaþarfir þínar.
2.Hitið við 65°C í 5 mínútur og kælið hratt á ís í 2 mínútur.
3.Bætið eftirfarandi íhlutum við ofangreint kerfi að heildarrúmmáli 20µL og blandið varlega saman:
| Íhlutir | Rúmmál (μL) |
| 5 × First-Strand Buffer | 4 |
| Neoscript Reverse Transcriptase (200 U/μL) | 1 |
| RNase hemill (40 U/μL) | 1 |
| RNase-frítt dH2O | Til 20 μL |
4.Vinsamlegast framkvæma hvarfið samkvæmt eftirfarandi skilyrðum:
(1) Ef Random Primer er notaður ætti að framkvæma hvarfið við 25 ℃ í 10 mínútur og síðan við 50 ℃ í 30 ~ 60 mínútur;
(2) Ef Oligo dT eða sérstakur grunnur er notaður, ætti að framkvæma hvarfið við 50 ℃ í 30 ~ 60 mínútur.
5.Hitið við 95 ℃ í 5 mínútur til að óvirkja Neoscript Reverse Transcriptase og stöðva hvarfið.
6.Hægt er að nota öfuga umritunarvörur beint í PCR viðbrögð og flúrljómunar magn PCR viðbrögð, eða geyma við -20 ℃ í langan tíma.
PCR Raðgerð:
1.Undirbúningur hvarfblöndunnar
| Íhlutir | Einbeiting |
| 10 × PCR buffer (dNTP ókeypis, Mg²+ ókeypis) | 1× |
| dNTP (10mM hver dNTP) | 200 μM |
| 25 mM MgCl2 | 1-4 mM |
| Taq DNA pólýmerasi (5U/μL) | 2-2,5 U |
| Grunnur 1 (10 μM) | 0,2-1 μM |
| Grunnur 2 (10 μM) | 0,2-1 μM |
| Sniðmáta | ≤10% fyrsta keðjuverkunarlausn (2 μL) |
| ddH2O | Til 50 μL |
Athugasemdir:a: Ef of mikilli fyrstu keðjuverkunarlausn er bætt við getur PCR-hvarfið verið hindrað.
2.PCR viðbragðsaðferð
| Skref | Hitastig | Tími | Hringrásir |
| Pre-denaturation | 95 ℃ | 2-5 mín | 1 |
| Denaturation | 95 ℃ | 10-20 sek | 30-40 |
| Hreinsun | 50-60 ℃ | 10-30 sek | |
| Framlenging | 72℃ | 10-60 sek |
Skýringar
1.Hentar fyrir öfuga umritunarhita fínstillingu á bilinu 42 ℃ ~ 55 ℃.
2.Það hefur betri stöðugleika, er hentugur fyrir öfuga umritun við háan hita.Að auki er það hagstætt til að fara á skilvirkan hátt í gegnum flókin byggingarsvæði RNA.Einnig þaðer hentugur fyrir eins þrepa multiplex flúrljómun magn RT-PCR greiningu.
3.Góð samhæfni við ýmis PCR mögnunarensím og hentar vel fyrir RT-PCR viðbrögð með mikilli næmni.
4.Hentar fyrir RT-PCR viðbrögð með mikilli næmni í einu skrefi flúrljómun, bætir í raun greiningarhraða lágstyrks sniðmáta.
5.Hentar fyrir byggingu cDNA bókasafns.
