Vaccinia Virus Capping Enzyme

Vaccinia veiru lokunarensím er dregið af raðbrigða E. coli stofni sem ber genin fyrir Vaccinia capping ensímið.Þetta eina ensím er samsett úr tveimur undireiningum (D1 og D12) og hefur þrjár ensímvirkni (RNA þrífosfatasa og gúanýlýltransferasa með D1 undireiningunni og gúanínmetýltransferasa með D12 undireiningunni).Vaccinia virus Capping Enzyme er áhrifaríkt til að hvetja myndun hettubyggingar, sem getur sérstaklega tengt 7-metýlgúanýlathúfubygginguna (m7Gppp, Cap 0) við 5′ enda RNA.Cap uppbygging (Cap 0) gegnir mikilvægu hlutverki í mRNA stöðugleika, flutningi og þýðingu í heilkjörnungum.Lokun RNA með ensímhvarfi er áhrifarík og einföld aðferð sem getur verulega bætt stöðugleika og þýðingu RNA fyrir in vitro umritun, transfektion og örsprautun.

Íhlutir

Vaccinia Virus Capping Enzyme (10 U/μL)

10×Capping Buffer

Geymsluskilyrði

-25～- 15 ℃ til geymslu （Forðist endurteknar frystingar-þíðingarlotur）

Geymsla biðminni

20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 100 mM NaCl,

1mM DTT, 0,1mM EDTA, 0,1% Triton X-100, 50% glýseról.

Eining Skilgreining

Ein eining af Vaccinia veiru Capping Enzyme er skilgreind sem magn ensíms sem þarf til að innlima 10pmol af GTP í 80nt afrit á 1 klukkustund við 37°C.

Gæðaeftirlit

Exonuclease:10U af Vaccinia veiru lokunarensími með 1μg λ-Hind III meltingar DNA við 37 ℃ í 16 klukkustundir gefur ekkert niðurbrot eins og ákvarðað er með rafdrætti á agarósa hlaupi.

Endonuclease:10U af Vaccinia virus Capping Enzyme með 1μg λDNA við 37 ℃ í 16 klukkustundir gefur ekkert niðurbrot eins og ákvarðað er með rafdrætti á agarósageli.

Nickase:10U af Vaccinia veiru Capping Enzyme með 1 μg pBR322 við 37 ℃ í 16 klukkustundir gefur ekkert niðurbrot eins og ákvarðað er með rafdrætti á agarósageli.

RNase:10U af Vaccinia virus Capping Enzyme með 1,6μg MS2 RNA í 4 klukkustundir við 37 ℃ gefur ekkert niðurbrot eins og ákvarðað er með rafdrætti á agarósageli.

1.coli DNA:10U af Vaccinia veiru Capping Enzyme er skimað fyrir tilvist E. coli erfðaefnis DNA með því að nota TaqMan qPCR með frumurum sem eru sérstakir fyrir E. coli 16S rRNA staðlinum.E. coli erfðamengun DNA er ≤1 E. coli erfðamengi.

2.Baktería Endotoxín: LAL-próf, samkvæmt kínverskri lyfjaskrá IV 2020 útgáfu, hlaupmörkprófunaraðferð, almenn regla (1143).Innihald endotoxíns úr bakteríum ætti að vera ≤10 ESB/mg.

Viðbragðskerfi og aðstæður

1. Capping Protocol (hvarfmagn: 20 μL)

Þessi aðferð á við um lokunarviðbrögð 10μg RNA (≥100 nt) og hægt er að stækka hana í samræmi við tilraunakröfur.

I) Sameina 10 μg RNA og nukleasafrítt H2O í 1,5 ml örflóttaglasi að lokarúmmáli 15,0 µL.*10×Capping buffer: 0,5M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25 ℃, pH 8,0)

2) Hitið við 65 ℃ í 5 mínútur og síðan ísbaði í 5 mínútur.

3) Bættu við eftirfarandi hlutum í þeirri röð sem tilgreind er

*10×Capping Buffer：0,5 M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25℃, pH8,0)

4) Ræktið við 37°C í 30 mínútur, RNA er nú lokað og tilbúið til notkunar á eftir.

2. 5′ flugstöð merkingarviðbrögð (hvarfmagn: 20 μL)

Þessi samskiptaregla er hönnuð til að merkja RNA sem inniheldur 5´ þrífosfat og hægt er að stækka hana í samræmi við kröfur.Skilvirkni innleiðingar merkimiða verður fyrir áhrifum af mólhlutfalli RNA: GTP, sem og GTP innihaldi í RNA sýnum.

1) Sameina viðeigandi magn af RNA og nukleasafríu H2O í 1,5 ml örflóttaglasi í lokarúmmálið 14,0 µL.

2) Hitið við 65 ℃ í 5 mínútur og síðan ísbaði í 5 mínútur.

3) Bættu við eftirfarandi hlutum í þeirri röð sem tilgreind er.

** GTP MIX vísar til GTP og fárra merkja.Fyrir styrk GTP, sjávið athugasemd 3.

4) Ræktað við 37°C í 30 mínútur, RNA 5′ endi er nú merktur og tilbúinn til niðurstreymis

Umsóknir

1. Lokun á mRNA fyrir þýðingarpróf/in vitro þýðingu

2. Merking 5' enda mRNA

Athugasemdir um notkun

1.Upphitun á RNA-lausninni fyrir ræktun með Vaccinia Capping Enzyme fjarlægir aukabyggingu á 5' enda umritsins.Lengdu tímann í 60 mínútur fyrir afrit með þekktum mjög uppbyggðum 5'endum.

2. RNA sem notað er við lokunarhvörf skal hreinsa fyrir notkun og dreifa í nukleasafríu vatni.EDTA ætti ekki að vera til staðar og lausnin ætti að vera laus við sölt.

3. Til að merkja 5´ endann ætti heildarstyrkur GTP að vera um það bil 1-3 sinnum mólstyrkur mRNA í hvarfinu.

4. Rúmmál hvarfkerfisins er hægt að minnka upp eða niður í samræmi við raunverulegt.