PNGase F
Peptíð-N-glýkósíðasi F(PNGase F) er áhrifaríkasta ensímaðferðin til að fjarlægja næstum allar N-tengdar fásykrur úr glýkópróteinum.PNGase F er amídasi, sem klofnar á milli innstu mestu GlcNAc og asparagínleifanna af háum mannósa, blendingum og flóknum fásykrum úr N-tengdum glýkópróteinum.
Umsókn
Þetta ensím er gagnlegt til að fjarlægja kolvetnaleifar úr próteinum.
Undirbúningur og forskrift
| Útlit | Litlaus vökvi |
| Hreinleiki próteina | ≥95% (frá SDS-PAGE) |
| Virkni | ≥500.000 einingar/ml |
| Exoglýkósíðasi | Ekki var hægt að greina virkni (ND) |
| Endoglýkósíðasi F1 | ND |
| Endoglýkósíðasi F2 | ND |
| Endoglýkósíðasi F3 | ND |
| Endoglýkósíðasi H | ND |
| Próteasi | ND |
Eiginleikar
| EB númer | 3.5.1.52(Raðbrigða frá örveru) |
| Mólþungi | 35 kDa (SDS-PAGE) |
| Isoelectric punktur | 8. 14 |
| Besta pH | 7,0-8,0 |
| Ákjósanlegur hiti | 65°C |
| Sérhæfni undirlags | Kljúfur glýkósíðtengi milli GlcNAc og asparagínleifa. Mynd 1 |
| Viðurkenningarsíður | N-tengd glýkan nema innihalda α1-3 fúkósa. Mynd 2 |
| Virkjarar | DTT |
| Inhibitor | SDS |
| Geymslu hiti | -25 ~-15 ℃ |
| Hita óvirkjun | 20µL hvarfblanda sem inniheldur 1µL af PNGase F er óvirkjuð með ræktun við 75 °C í 10 mínútur. |
Mynd 1 Undirlagssérhæfni PNGase F
Mynd 2 Viðurkenning situr á PNGase F.
Þegar innri GlcNAc leifar eru tengdar α1-3 fúkósa, getur PNGase F ekki klofið N-tengdar fásykrur úr glýkópróteinum.Þessi breyting er algeng í plöntum og sumum skordýra glýkópróteinum.
Cstjórnarliðar
|
| Íhlutir | Einbeiting |
| 1 | PNGase F | 50 µl |
| 2 | 10×Glycoprotein Denaturing Buffer | 1000 µl |
| 3 | 10×GlycoBuffer 2 | 1000 µl |
| 4 | 10% NP-40 | 1000 µl |
Skilgreining eininga
Ein eining(U) er skilgreint sem magn ensíms sem þarf til að fjarlægja >95% af kolvetninu úr 10 µg af náttúrulegum RNase B á 1 klukkustund við 37°C í heildarhvarfsrúmmáli 10 µL.
Viðbragðsskilyrði
1.Leysið 1-20 µg af glýkópróteini með afjónuðu vatni, bætið við 1 µl 10×Glycoprotein Denaturing Buffer og H2O (ef nauðsyn krefur) til að fá 10 µl heildarhvarfsrúmmál.
2.Ræktað við 100°C í 10 mínútur, kælt það á ís.
3.Bætið við 2 µl 10×GlycoBuffer 2, 2 µl 10% NP-40 og blandið saman.
4.Bætið við 1-2 µl PNGase F og H2O (ef nauðsyn krefur) til að búa til 20 µl heildarhvarfmagn og blandað.
5.Ræktað hvarf við 37°C í 60 mín.
6.Fyrir SDS-PAGE greiningu eða HPLC greiningu.
