mRNA Cap2'-O-Methyltransferasa

mRNA Cap 2´ -O-metýltransferasi var unninn úr raðbrigða E. coli stofni sem ber genið fyrir vaccinia mRNA Cap 2 ´-O-Methyltransferasa.Þetta ensím bætir við metýlhópi í 2´-O stöðu fyrsta núkleótíðsins sem liggur að lokbyggingunni við 5´enda RNA. Ensímið notar S-adenósýlmeþíónín (SAM) sem metýlgjafa til að metýlera lokuð RNA (hettu) -0) sem leiðir til cap- 1 uppbyggingu.

Cap1 uppbyggingin getur aukið þýðingarskilvirkni, bætt tjáningu mRNA í transfection og örsprautunartilraunum. Þetta ensím þarf sérstaklega RNA með m7GpppN loki sem hvarfefni.Það getur ekki notað RNA með pN, ppN, pppN eða GpppN í 5' endanum.Hægt er að búa til lokuð RNA með in vitro umritun með því að nota cap hliðstæðu eða með ensímþekju með því að nota Vaccinia Capping Enzyme.

Íhlutir

mRNA Cap 2´-O-Methyltransferasi (50U/μL)

10×Capping Reaction Buffer

Geymsla

-25 ～- 15 ℃ til geymslu （ Forðastu endurteknar frystingar-þíðingarlotur）

Geymsla biðminni

20 mM Tris-HCl (pH 8,0，25℃), 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 0,1% Triton X-100, 50% glýseról.

Skilgreining eininga

Ein eining er skilgreind sem magn ensíms sem þarf til að metýlera 10 pmól af 80 nt lokuðu RNA umriti á 1 klukkustund við 37°C.

Gæðaeftirlitspróf

Exonuclease:50U af mRNA Cap 2 ´-O-Methyltransferasa með 1μg λ-Hind III meltingar-DNA við 37 ℃ í 16 klukkustundir gefur ekkert niðurbrot eins og ákvarðað er með rafdrætti á agarósageli.

Endónukleasi: 50 U af mRNA Cap 2 ´-O-Methyltransferasa með 1 μg λDNA við 37 ℃ í 16 klukkustundir gefur ekkert niðurbrot eins og ákvarðað er með rafdrætti á agarósageli.

Nickase: 50U af mRNA Cap 2 ´-O-Methyltransferasa með 1μg pBR322 við 37 ℃ í 16 klukkustundir gefur ekkert niðurbrot eins og ákvarðað er með rafdrætti á agarósageli.

RNase: 50U af mRNA Cap 2 ´-O-Methyltransferasa með 1,6μg MS2 RNA í 4 klukkustundir við 37 ℃ gefur ekkert niðurbrot eins og ákvarðað er með rafdrætti á agarósageli.

E. coli DNA: 50U af mRNA Cap 2 ´ -O-Methyltransferasa er skimað fyrir tilvistE. coli erfðafræðilegt DNA með TaqMan qPCR með primerum sem eru sérstakir fyrirE. coli 16S rRNA staðsetning.TheE. coli erfðafræðileg DNA mengun er =1E. coli erfðamengi.

Baktería Endotoxín: LAL-próf, samkvæmt kínverskri lyfjaskrá IV 2020 útgáfu, hlaupmörkprófunaraðferð, almenn regla (1143).Innihald endotoxíns úr bakteríum ætti að vera =10 ESB/mg.

Viðbragðskerfi og aðstæður

1. Sameina hæfilegt magn af lokuðu RNA og RNase-fríu H2O í 1,5 ml örflóttaglasi í lokarúmmálið 16,0 µL.

2. Hitið við 65 ℃ í 5 mínútur og síðan er ísbað í 5 mínútur.

3. Bættu við eftirfarandi íhlutum í þeirri röð sem tilgreind er (fyrir metýleringu á afmörkuðu RNA

færri en 10

*10× Capping Reaction Buffer: 500 mM Tris-HCl (pH 8,0, 25 ℃), 50 mM KCl, 10 mM MgCl2 、 10 mM DTT.

4. Ræktað er við 37 ℃ í 1 klukkustund (mælt er með 2 klst ræktun fyrir markbútinn sem er minna en 200 nt).

Umsóknir

Til að bæta mRNA tjáningu meðan á örsprautun og transfection tilraunum stendur.

Athugasemdir um notkun

1. Fyrir hvarf skal hreinsa RNA og leysa það upp í nukleasafríu vatni, allar lausnir ættu ekki að innihalda nein EDTA og jónir.

2. Mælt er með því að hita RNA-sýnishornið við 65 ℃ í 5 mínútur fyrir hvarf til að fjarlægja aukabygginguna á 5' enda afritsins.Það gæti verið framlengt í 10 mínútur fyrir flókna 5'-terminal uppbyggingu.