Tvíþátta RNA (dsRNA) ELISA KIT

Þetta sett er ensímtengd ónæmissogandi prófun (ELISA) tenging við biotin-Streptavidin kerfi, til magnmælinga á dsRNA með lengd yfir 60 basapörum (bp), óháð röðinni.Platan hefur verið forhúðuð með and-dsRNA mótefni.dsRNA sem er til staðar í sýninu er bætt við og binst mótefnum sem eru húðuð á brunnunum.Og svo er biotinyleruðu and-dsRNA mótefni bætt við og binst dsRNA í sýninu.Eftir þvott er HRP-Streptavidin bætt við og binst Biotinylated and-dsRNA mótefnið.Eftir ræktun er óbundið HRP-Streptavidin skolað í burtu.Síðan er TMB hvarfefnislausn bætt við og hún er hvötuð með HRP til að framleiða bláa litavöru sem breyttist í gult eftir að súrri stöðvunarlausn var bætt við.Þéttleiki guls er í réttu hlutfalli við markmagn dsRNA sem er fangað í plötu.Gleypið er mælt við 450 nm.

Umsókn

Þetta sett er til magnmælinga á leifum dsRNA.

Kit íhlutir

Geymsla og stöðugleiki

1. Fyrir ónotað sett: Allt settið gæti verið geymt við 2 ~ 8 ℃ í geymsluþol.Forðast skal sterkt ljós fyrir stöðugleika í geymslu.

2. Fyrir notað sett: Þegar örplatan er opnuð, vinsamlegast hyljið ónotaða brunna með plötuþéttiefni og farðu aftur í álpappírspokann sem inniheldur þurrkefnispakkann, lokaðu álpappírspokanum með rennilás og farðu aftur í 2~8 ℃ eins fljótt og auðið er eftir notkun.Önnur hvarfefni ætti að skila í 2 ~ 8 ℃ eins fljótt og auðið er eftir notkun.

Efni sem þarf en fylgir ekki

1. Örplötulesari með 450±10nm síu (betra ef hægt er að greina við 450 og 650 nm bylgjulengd).

2. Örplötuhristari.

3. RNase-frjáls odd og skilvindu rör.

Aðgerðarflæðirit

Áður en þú byrjar

1. Komdu öllum búnaðarhlutum og sýnum í stofuhita (18-25 ℃) fyrir notkun.Ef settið verður ekki notað í einu, vinsamlegast takið aðeins út strimla og hvarfefni fyrir núverandi tilraun, og látið eftirstandandi ræmur og hvarfefni vera í nauðsynlegu ástandi.

2. Þvottajafnari: þynntu 40mL af 20x óblandaðri þvottajafna með 760mL af afjónuðu eða eimuðu vatni til að búa til 800mL af 1x þvottajafna.

3. Staðlað: Snúið eða skilið stofnlausninni stuttlega fyrir notkun.Styrkur fjögurra staðla sem gefnir eru upp er 5ng/μL.Fyrir UTP og pUTP dsRNA staðla, vinsamlegast þynntu stofnlausnina í 1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312,0.0156,0pg/μL með STE biðminni til að draga upp staðlaða ferilinn.Fyrir N1-Me-pUTP dsRNA staðla, vinsamlegast þynnið stofnlausnina í 2,1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312, 0pg/μL með STE biðminni til að draga upp staðlaða ferilinn.Fyrir 5-OMe-UTP dsRNA staðal, vinsamlegast þynnið stofnlausnina í 4,2,1,0,5, 0,25,0,125,0,0625, 0pg/μL með STE biðminni til að draga upp staðlaða ferilinn.Við mælum með að hægt sé að þynna staðla eins og eftirfarandi töflur:

4. Bíótínýlerað greiningarmótefni og HRP-streptavidin vinnulausn: Snúið eða skilið stofnlausninni stuttlega fyrir notkun.Þynntu þau að vinnustyrknum með þynningarjafna.

5. TMB undirlag: Sogðu upp nauðsynlegan skammt af lausninni með sótthreinsuðum oddum og dældu ekki afgangslausninni í hettuglasið aftur.TMB undirlag er viðkvæmt fyrir ljósi, ekki útsett TMB undirlag fyrir ljósi í langan tíma.

Að nota siðareglur

1. Ákveðið fjölda ræma sem þarf fyrir greiningu.Settu ræmurnar í rammana til notkunar.Eftirstöðvar plötustrimla sem ekki eru notaðar í þessari greiningu ætti að pakka aftur í poka með þurrkefni.Lokaðu pokanum vel til að geyma í kæli.

2. Bætið 100μL af hverri þynningu af staðli, núllsýni og sýnum í viðeigandi brunna.Lokið með plötuþéttingunni.Ræktað í 1 klst við stofuhita með hristingu við 500 snúninga á mínútu.Sýnin ættu að þynna með STE jafnalausn í viðeigandi styrk til að fá nákvæma greiningu.

3. Þvottaskref: Sogðu upp lausnina og þvoðu með 250μL þvottabuffi í hvern brunn og láttu hana standa í 30 sekúndur.Fleygðu þvottabuffi alveg með því að smella plötunni á ísogandi pappír.Þvoið alveg 4 sinnum.

4. Bætið 100μL af bíótínýleruðu greiningarmótefnavinnulausn í hvern brunn.Lokið með plötuþéttingunni.Ræktað í 1 klst við stofuhita með hristingu við 500 snúninga á mínútu.

5. Endurtaktu þvottaskref.

6. Bætið 100μL af HRP-streptavidin vinnulausn í hvern brunn.Lokið með plötuþéttingunni.Ræktað í 30 mínútur við stofuhita með hristingu við 500 snúninga á mínútu.

7. Endurtaktu þvottaskrefið aftur.

8. Bætið 100μL af TMB hvarfefnislausn í hvern brunn.Lokið með plötuþéttingunni.Ræktað í 30 mínútur við RT Verndaðu gegn ljósi.Vökvinn verður blár með því að bæta við hvarfefnislausn.

9. Bætið 50μL af stöðvunarlausn í hvern brunn.Vökvinn verður gulur með því að bæta við stöðvunarlausn.Keyrðu síðan örplötulesarann ​​og framkvæmdu mælingu við 450nm strax.

Útreikningur á niðurstöðum

1. Taktu meðaltal af tvíteknum aflestri fyrir hvern staðal, eftirlit og sýni og dragðu frá meðaltali núll staðlaðs ljósþéttleika.Búðu til staðlaðan feril með gleypni á lóðrétta(Y) ásnum og dsRNA styrk á lárétta(X） ásnum.

2. Mælt er með því að framkvæma útreikninginn með tölvutengdum hugbúnaði til að passa feril eins og kúrfusérfræðing 1.3 eða ELISA Calc í 5 eða 4 breytum ólínulegu aðlögunarlíkani.

Frammistaða

1. Næmi:

neðri greiningarmörk: ≤ 0,001pg/μL (fyrir UTP-, pUTP-, N1-Me-pUTP-dsRNA), ≤ 0,01pg/μL (fyrir 5-OMe-UTP-dsRNA).

neðri mörk magngreiningar: 0,0156 pg/μL (fyrir UTP-, pUTP-dsRNA), 0,0312 pg/μL (fyrir N1-Me-pUTP-dsRNA), 0,0625 pg/μL (fyrir 5-OMe-UTP-dsRNA).

2. Nákvæmni: CV á innangreiningu ≤10%, ferilskrá milligreiningar ≤10%

3. Bati: 80% ~ 120%

4.Línulegleiki:0,0156-0,5pg/μL(fyrirUTP-,pUTP-dsRNA)0,0312-1pg/μL(fyrirN1-Me-pUTP dsRNA),0,0625-1pg/μL(fyrir 5-OMe-UTP-dsRNA).

Hugleiðingar

1. TMB hvarfhitastig og tími er mikilvægur, vinsamlegast stjórnaðu þeim í samræmi við leiðbeiningarnar stranglega.

2. Til að ná góðum endurgerðanleika og næmni greiningar er nauðsynlegt að þvo plöturnar rétt til að fjarlægja umfram óhvarfað hvarfefni.

3. Blanda skal öllum hvarfefnum vandlega fyrir notkun og forðast bólur meðan á sýni eða hvarfefnum er bætt við.

4. Ef kristallar hafa myndast í óblandaða þvottalausninni (20x), hitið að 37 ℃ og blandið varlega saman þar til kristallarnir eru alveg uppleystir.

5. Forðastu greiningu á sýnum sem innihalda natríumazíð (NaN3), þar sem það gæti eyðilagt HRP virkni sem leiðir til vanmats á magni dsRNA.

6. Forðist RNase mengun meðan á prófun stendur.

7. Staðallinn/sýnin, greiningarmótefni og SA-HRP er einnig hægt að framkvæma við RT án þess að hrista, en það getur valdið því að greiningarnæmi minnkar um einn falt.Í þessu tilviki mælum við með að UTP og pUTP dsRNA staðlar séu þynntir úr 2pg/μL, N1-Me-pUTP dsRNA staðlar ættu að þynna úr 4pg/μL og 5-OMe-UTP dsRNA staðall ætti að þynna úr 8pg/μL.Að auki skaltu rækta HRP-streptavidin vinnulausn í 60 mínútur við stofuhita.Ekki nota flöskuhristara, því flöskuhristari getur leitt til ónákvæmrar niðurstöðu.

Dæmigert niðurstaða

1. Stöðluð ferilgögn

2. Staðlað ferilútreikningur

3. Liner greiningarsvið: 0,0312- 1pg/μL